發布時間：2019-07-03
“起初神創造天地，地是空虛混沌，淵面黑暗，神的靈運行在水面上。神說，要有光，就有了光。神看光是好的，就把光暗分開了。”創世紀中這段話表明，是光照亮了混沌的天地。對我們而言，大腦是什么樣子的呢，它是什么結構呢？即使把它打開，我們也無從得知它的工作原理。大腦這片混沌的世界，即使我們擁有它，它卻是個謎。但是，讓我們大開腦洞地想象一下，假如，大腦的世界里有了光呢？
2007年，哈佛大學的神經生物學家杰夫？W？里奇曼（Jeff W. Lichtman）和他的團隊研發了一項名叫“腦彩虹”（Brainbow）的技術，他們利用熒光蛋白能讓小鼠的神經細胞同時顯示出幾十種不同的色彩。這些熒光蛋白，照亮了黑暗的大腦，使某些需要研究的細胞光明，從而與錯綜復雜的黑暗背景區分開來。從此，大腦這片混沌天地不僅有了光，還是不同顏色種類的光。通過對不同色彩的分析，可以計數細胞，也可以追蹤細胞的走向，觀察神經網絡的連接布局以及細胞之間的相互作用。大腦這片天地有了光，就好像創世紀一般，開始進入全新的世界了。如果借助傳統技術完成這項任務，可能需要數十萬年時間。這一次，開天地的，不是神，而是科學家。他們是怎樣走到這一步的呢？就讓我們來看看大腦的發光之路。
圖片來源：Livet, J., et al. (2007). "Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system."Nature 450(7166): 56-62.
20世紀初，科學家們利用組織及細胞自發熒光來觀察研究原生動物。會發光的細胞，就像人群中穿著不一樣顏色衣服的人，不會淹沒在人群中。一眼望去，很容易發現他。但是天然熒光生物分子種類有限，強度較弱，而且大多數分子是不發光的。于是，科學家們研究出了熒光探針技術，將那些原本不發光的生物分子標記上熒光分子，使得他們在周圍組織和細胞中像黑暗中的星星那樣閃閃發光，可以輕易被人們的視線捕捉到。
那么，這些人造的熒光從何而來呢？故事要從我們“衣食住行”中的“衣”講起。人類在發明紡織的同時，也發展了染色技術。剛開始的時候，人們只是運用天然染料，例如，植物的花、葉、樹皮，礦物中的朱砂、雄黃等。直至19世紀，英國人發現笨胺紫能將絲織品染成紫紅色，繼而開創了化學合成染料的工業紀元。等等，我們不是要講大腦的熒光嗎？怎么還講到紡織業了呢？其實，看似無關的領域，科學家們可是觸類旁通：既然染料可以染紡織品，為什么不能用來染生物體呢？20世紀30年代起，這些有機小分子染料開始被用于活體細胞和組織的熒光顯微成像染色。
僅有光是不夠的，我們不能照亮所有的區域，我們要只照亮感興趣的區域，這就需要熒光探針具有特異性。如何做到呢？除了熒光基團，熒光探針分子還有識別基團和連接體部分。識別基團是探針的“向導”，決定探針分子的選擇性和特異性，負責找到感興趣的基團。連接體負責連接識別基團和熒光基團。這樣的結構，起到了識別基團找到了感興趣的分子的同時，熒光基團也就被一起“綁”在上面了的作用，感興趣的分子這樣和黑暗分開了。有機小分子具有強大的可塑性和應用潛力，通過對其結構進行巧妙設計和改造，能夠設計合成出滿足各種需要的熒光探針。當下，已經有細胞活性探針、膜熒光探針、細胞器探針、電位敏感探針、活性氧探針等功能各異的探針。他們被用于研究大腦結構和功能的方方面面。
有機小分子熒光探針的幾種機制
鋅是重要的神經化學因子，與大腦發育和智力有關。當鋅含量過高或過低時，就會導致多種疾病，而直接檢測離子含量并不容易，熒光探針對此卻易如反掌。它可以將離子濃度轉化為熒光強度，通過顯微鏡成像，我們就可以間接檢測出鋅離子含量。它是如何實現的呢？首先，它的識別基團——鄰氨基苯硫醚可以和鋅離子結合，熒光基團是香豆素，兩者以席夫堿相連，席夫堿抑制了香豆素的發光。所以這個探針平時是黑暗的。但是當鋅離子存在時，可以與識別基團上的硫原子、連接體上的氮原子和熒光基團上的氧原子配位，整個熒光探針分子構象變化，香豆素回到了可以發光的構象，讓熒光從無到有，光明表示著鋅離子的存在。
雖然有機小分子可塑性良好，但是一些有機小分子熒光探針的非水溶性及毒副作用、光漂白性等，使其在生命科學、醫學等領域中的應用受到了限制。
1955年，有人發現水母可以發綠光，但不知其原因。1962年，日裔美國科學家下村修（Osamu Shimomura）和美國科學家約翰森（Frank H. Johnson）從水母中分離生物發光蛋白——水母素時，意外地發現了一個副產物——綠色熒光蛋白（GFP），它在陽光下呈綠色。1974年，他們提取到了這種蛋白質。
GFP發光原理（來源于網絡圖片）
GFP的發光過程需要發光蛋白Aequorin的幫助。水母體內的Aequorin與鈣離子結合會發出藍光，藍光會立刻被一種蛋白吸收，發出綠色熒光。
20世紀80年代，美國科學家普魯切（Douglas Prasher）成功地克隆出了水母中編碼綠色熒光蛋白的基因，使得熒光蛋白標記的大量應用成為可能。1994年美國科學家沙爾菲（Martin Chalfie）利用PCR技術擴增了GFP的編碼區，成功地將它克隆到大腸桿菌和線蟲細胞中，通過紫外線或藍光激發，均產生了很美妙的綠色熒光。沙爾菲的這項研究首次證實了GFP作為發光標記物用于生物學研究的價值，這才是GFP作為熒光指示劑的真正突破。
由于熒光蛋白的“發光”基本不需要外來物質“刺激”，并且具有極佳的穩定性，對生命體也無毒害，因此，熒光蛋白可以在各種有機生命體內“點亮”科研人員想要研究的分子或者基因。
盡管野生型GFP能發出很絢麗的熒光，但它還是有不少缺點，比如有兩個激發峰、光穩定性不好、在37℃不能正確折疊等。生物學家們發揮主觀能動性的的時候到了。1994年，美籍華裔科學家錢永健首次完成對GFP發光基團周圍殘基的重大改造，得到了多種改良型的GFP。改良過的GFP增強了其光譜性質、熒光強度和光穩定性，折疊能力也得到改善，顏色也從原來的綠色熒光蛋白到現在的藍色、藍綠色、黃色熒光蛋白。
基于以上研究，下村修、沙爾菲和錢永健獲得了2008年的諾貝爾化學獎，熒光蛋白的研究也被稱為“點亮”科學。值得八卦一下的是，普魯切并沒有得到諾獎，作為發現GFP基因并把它免費饋贈給這些諾貝爾獲獎者的科學家，普魯切最終卻因為找不到一份科學領域的工作，成了一位開巴士的司機，令人扼腕嘆息。
來自錢永健實驗室的熒光細菌畫（來自錢永健實驗室）
在科學界，熒光蛋白被稱為生物化學的“北斗星”。通過常規的基因操縱手段，用熒光蛋白來標記目標蛋白，可以跟蹤和判斷生物細胞的實時分子變化，了解以前看不到的生物過程，例如細胞分裂、染色體復制和分裂，發育和信號轉導，腫瘤細胞的轉移等過程。因為色彩鮮艷，熒光蛋白甚至被應用到商業領域，2003年美國約克鎮的家庭寵物熒光魚就是其商業應用的首個案例。
（圖片來源：新聞網頁）
但是在腦科學研究領域，要想把數量龐大、錯綜復雜的神經細胞彼此區分開，還需要更新的技術。不僅如此，神經細胞之間的聯系更是錯綜復雜。每個細胞就好像一個立交橋，可以把自己的信號傳到成千個細胞，同時也可以接受成千個細胞的信號輸入。如果我們的技術只停留在看到一團神經細胞，分不清他們誰是誰，我們怎么研究這樣復雜的大腦呢？恐怕連盲人摸象的水平都不如。腦彩虹技術解決了區分單個神經細胞的方法，使不同的神經元呈現不同的顏色。但是，這是如何實現的呢？因為我們熒光蛋白的種類雖然已經很多了，但是仍然是有限的，不可能做到每種神經元都攜帶一種顏色的水平啊。但是我如果問你，你畫出的畫有很多種顏色，你是否也需要成千上萬種顏料呢？你會覺得我傻啊，因為顏色是可以調的，只要有幾種基礎顏色，這個多一點，那個少一點，就可以配出五彩繽紛的色彩。同樣地，我們的科學家也利用了這樣的思路，他們讓小鼠的每個神經細胞同時擁有紅、綠、黃、藍、青等幾種熒光蛋白，通過調控各自的比例，就可以產生特定的色彩。怎樣控制這些神經三原色的比例呢？這就需要轉基因手段了。為了達到這一目標，科學家們下了一局很大的棋。他們在神經系統發育早期，就利用Cre-Lox 重組方法改造了神經干細胞。干細胞每次增殖都會產生兩個一模一樣的姊妹細胞，它們的基因一樣，顏色也是一樣的。但是這兩個姊妹細胞的子代，基因會因為重組而和親代有所不同，顏色也就會由于重組丟失不同的熒光蛋白而發生變化。最后達到成熟的神經細胞，攜帶著不同的基因，也就具有獨特的紅、黃、藍熒光蛋白比例，產生特定的顏色。
但是要拍出好看的照片，光有一張漂亮的臉是不夠的，相機本身也很重要。要不怎么有“單反窮三代”這樣的說法呢？無論是對有機小分子熒光探針的研究，還是對熒光蛋白的改進，都好像是把拍照的人變美了。所謂好馬配好鞍，檢測熒光信號的熒光顯微鏡的研究怎么能落后呢？現如今，三光子激發、光子隨機重構、光激活和光轉換熒光蛋白、振鏡掃描、高速攝像機等，都是從成像原理上進行改進，有效地提高了顯微鏡的時間空間分辨率和觀察深度。熒光蛋白和熒光顯微鏡的結合，完全是“你負責貌美如花，我負責賺錢養家”的節奏。現如今，高分辨率的核磁成像也加入到了熒光掃描的隊列中。
最后，讓我們來欣賞一些閃閃發光的神經元吧。他們在被“點亮”之前，沒有人知道他們在哪里，長什么樣，又在做些什么，整個大腦就像一片未知的混沌。如今，得益于熒光蛋白，大腦也開始揭開它神秘的面紗。
（圖片來源：小鼠海馬來源于Livet, J., et al. (2007). "Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system."Nature450(7166): 56-62.；小鼠背側中縫核的5-羥色胺神經元的全腦投射：周立攝制；小鼠視網膜神經節細胞：王飛 攝制）
（審核:胡謙、顧勇）
參考資料
Livet, J., et al. (2007). "Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system."Nature450(7166): 56-62.
http://www.huffingtonpost.com/2013/10/31/nikon-small-world-photos_n_4182182.html
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