發(fā)布時(shí)間：2023-06-25 15:02:00
2023年6月23日，《Genome Biology》期刊發(fā)表了題為《CATI: an efficient gene integration method for rodent and primate embryos by MMEJ suppression》的研究論文，該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉真研究組和非人靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)合作完成。研究人員通過使用RNA基因編輯工具CasRX下調(diào)參與MMEJ修復(fù)的關(guān)鍵基因DNA聚合酶θ（polq），在小鼠胚胎中顯著提高了線性化雙鏈DNA以及單鏈短DNA片段（ssODN）外源模板的基因敲入效率，該基因敲入方法被命名為CATI（CasRX-assisted targeted integration）（圖1）。此外，利用CATI的方法也能提升食蟹猴胚胎基因敲入的效率。
圖1 CATI策略的原理圖
對(duì)哺乳動(dòng)物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)基因整合是一項(xiàng)低效，但具有重要價(jià)值的研究手段。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯工具的出現(xiàn)，為制備精準(zhǔn)基因編輯的動(dòng)物模型提供了高效手段。CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用Cas9核酸酶與單鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA），通過有效誘導(dǎo)基因組中特定位點(diǎn)發(fā)生DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break, DSB），從而進(jìn)行基因組編輯。DSB主要由非同源末端連接（NHEJ）、微同源末端連接（MMEJ）和同源重組（HDR）三種機(jī)制來修復(fù)。相比NHEJ和MMEJ修復(fù)途徑中不可預(yù)測(cè)的堿基插入或者刪除，HDR通路利用與DSB位點(diǎn)周圍區(qū)域具有同源序列的模板（內(nèi)源性或外源性DNA）為供體模板，以精確重組的方式修復(fù)DNA，可以實(shí)現(xiàn)基因組DNA的精準(zhǔn)基因插入、刪除以及單個(gè)核苷酸的替換。因此，基于HDR的基因編輯方法為開發(fā)安全、高精度的人類疾病基因治療技術(shù)提供了基礎(chǔ)。然而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中，HDR修復(fù)效率非常低，這限制了精準(zhǔn)編輯在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用。近年來，很多研究人員致力于從抑制NHEJ、激活HDR通路、控制細(xì)胞周期等方面提高HDR效率（Ma et al., Cell Res, 2017; Zhao et al., Nucleic Acids Res, 2022; Quadros et al. Genome Biol., 2017）。
該研究針對(duì)21個(gè)基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)了88條sgRNA，對(duì)1500枚小鼠胚胎進(jìn)行基因編輯，通過Sanger測(cè)序鑒定sgRNA的編輯效率以及靶標(biāo)位點(diǎn)的DNA修復(fù)模式。分析發(fā)現(xiàn)sgRNA編輯的效率越高，MMEJ修復(fù)模式所占的比例越高。注射后胚胎的RNA-seq及Q-PCR數(shù)據(jù)表明，外源DNA模板的存在會(huì)誘導(dǎo)MMEJ修復(fù)的核心蛋白polq的基因表達(dá)上升。通過結(jié)合Cas9介導(dǎo)的基因敲入和CasRX介導(dǎo)的Polq基因敲低的CATI策略，研究人員成功在小鼠十多個(gè)位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了基因敲入效率的提升，其中3個(gè)位點(diǎn)的胚胎通過移植獲得了基因敲入小鼠，這些小鼠敲入的基因型可以被傳遞到下一代，證明了CATI在動(dòng)物模型構(gòu)建中的應(yīng)用潛力。
該研究還以腦智卓越中心楊輝研究組提出的線性化供體模板為基礎(chǔ)（Yao et al., Dev Cell, 2018），在小鼠胚胎水平上，整體比較分析了此前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的10種具有代表性的基因敲入效率提升方法。發(fā)現(xiàn)二細(xì)胞時(shí)期胚胎注射策略（Gu et al., Nat Biotechnol, 2018）可以被穩(wěn)定重復(fù)，在與CATI策略結(jié)合后可以進(jìn)一步提升敲入效率，在Actb位點(diǎn)的敲入效率最高達(dá)到了91.3%。此外，CATI在非人靈長(zhǎng)類胚胎中同樣可以提升效率，在測(cè)試的CDX2位點(diǎn)上，敲入效率從37.9%提升到64.9%，在H3.3B位點(diǎn)上從50.8%提升到74.5%。
最后，研究人員對(duì)CATI策略進(jìn)行了全面的安全性評(píng)估。GOTI實(shí)驗(yàn)表明，CATI技術(shù)并不會(huì)引入更多的突變和基于Cas9的脫靶；全基因組進(jìn)行序列分析同樣發(fā)現(xiàn)，CATI不會(huì)引入更多的外源DNA模板的隨機(jī)整合；對(duì)編輯位點(diǎn)附近序列進(jìn)行三代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CATI可以有效減少大片段的缺失。CATI策略為疾病動(dòng)物模型的開發(fā)以及基因疾病的臨床治療提供了新的選擇。
腦智卓越中心陳紅玉博士、博士研究生劉星辰和碩士研究生李蘭心為該論文共同第一作者。劉真研究員、孫強(qiáng)研究員、陸宗陽博士為該論文的共同通訊作者。該研究得到科技部、中國(guó)科學(xué)院、上海市和基金委的資助。感謝腦智卓越中心光學(xué)成像平臺(tái)、分子細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)對(duì)本工作提供的有力支持。
來源：劉真研究組、非人靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)
文字：劉真、陳紅玉
圖片：劉真、陳紅玉
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